【產(chǎn)品名稱】霍亂弧菌O139(VCO139)PCR試劑盒

【包裝規(guī)格】 50T/盒

【產(chǎn)品方法】實(shí)時熒光PCR法

【預(yù)期用途】

適用于檢測，可用于臨床霍亂弧菌O139(VCO139)感染的輔助診斷，但不作確診使用。

霍亂弧菌O139(VCO139)PCR試劑盒【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒采用 TaqMan 探針法實(shí)時熒光 PCR 技術(shù)，設(shè)計(jì)一對霍亂弧菌O139(VCO139)特異性引物，結(jié)合一條特異性探針， 利用相應(yīng)儀器對 PCR 過程進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測，實(shí)現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析，用于臨床上對可疑感染者的病原 學(xué)診斷。

【主要組成成份】

反應(yīng)液、酶液、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次，有效期 12 個月。

【適用儀器】
ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【保存和運(yùn)輸】 上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸， 嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

【使用方法】 

1 樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理 

血液、體液和棉拭子樣本取 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。

1.2 核酸提取

推薦采用核酸提qu或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進(jìn)行核酸提qu， 請按照試劑說明書進(jìn)行操作。

2. 試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)） 

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N（N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；反應(yīng)管 數(shù)每滿 10 份，多配制 1 份），每測試反應(yīng)體系配制如下表：

3.加樣（樣本處理區(qū)） 

將步驟 1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短 暫離心。

4.PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL； 熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

2.結(jié)果分析判定

2.1 結(jié)果分析條件設(shè)定 設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機(jī)器自動分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像 調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值（一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)）、stop 值（一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)），以及 Threshold 的 Value 值（上下拖動閾值線至高于陰性對照），重新分析結(jié)果。

2.2 結(jié)果判斷 陽性：檢測通道 Ct 值≤35，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線； 可疑：檢測通道 35值≤38，建議重復(fù)檢測，如果檢測通道仍為 35值≤38，且曲線有明顯的增長曲線， 判定為陽性，否則為陰性； 陰性：樣本檢測結(jié)果 Ct 值>38 或無 Ct 值。

3.質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

 陰性質(zhì)控品：Ct>38 或無 Ct 值顯示； 陽性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時滿足，否則實(shí)驗(yàn)視為無效。

4.檢測方法的局限性 

1.樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

3.陽性對照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果；

4.病原體在流行過程中基因突變、重組，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

5.不同的提取方法存在提取效率差異，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

6.試劑運(yùn)輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果；
7.本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項(xiàng)】

1.所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行；

2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，完quan混勻并短暫離心；

3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；

7.實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。
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